Совершенствование способов оценки качества корней и сиропа солодки

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Биология
Узнать стоимость новой

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 615. 322:582. 736:547. 463.2. 06:543. 544.5. 068. 7
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБОВ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КОРНЕЙ И СИРОПА СОЛОДКИ
© М. В. Гаврилин, С. П. Сенченко, А. М. Тамирян, А.В. Печенова
Пятигорская государственная фармацевтическая академия, пр. Калинина, 11, Пятигорск, Ставропольский край, 357 500 (Россия) E-mail: asp_nauka@mail. ru
Для совершенствования методик анализа количественного содержания кислоты глицирризиновой в корнях и сиропе солодки проведена сравнительная оценка методами ВЭЖХ, КЭ и СФ. Показаны достоверная сходимость между методами ВЭЖХ и КЭ и значительное завышение результатов, полученных методом спектрофотометрии.
Для электрофоретического определения КГ разработана методика, основанная на использовании в качестве ведущего электролита раствора натрия тетрабората (10 мг/мл) с добавкой Р-циклодекстрина в количестве 1 мМ.
Ключевые слова: солодка, капиллярный электрофорез, высокоэффективная жидкостная хроматография, капиллярный электрофорез, додецилсульфат натрия, Р-циклодекстрин.
Введение
Солодка голая (Glycyrrhiza glabra L.) — давно и широко известное лекарственное растение. Содержащаяся в корнях солодки глицирризиновая кислота (КГ) обладает широким спектром биологической активности. Для количественного определения этого соединения в сырье и лекарственных препаратах в России традиционно используется метод спектрофотомерии. Нормативная документация на сырье солодки нормирует нижний предел содержания глицирризиновой кислоты на уровне 6%. Вместе с тем опыт показывает, что результаты часто отягощены систематической ошибкой. Это может быть связано как с неполнотой извлечения, так и с недостаточной очисткой выделенной глицирризиновой кислоты. В этой связи с этим представляется, что более достоверные результаты даст применение сепарационных методов, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография и капиллярный зонный электрофорез.
В [1] описана методика ВЭЖХ определения КГ в корнях Glycyrrhiza uralensis Fisch. на колонке Varian Polaris RP C18-A длиной 250 мм. В качестве подвижной фазы применялась смесь раствора фосфорной кислоты (1%) и ацетонитрила 60: 40, детектирование осуществлялось при 254 нм. Линейность находилась в интервале 14−558 мкг/мл, открываемость составила 98,4±3,4%. Известно и использование системы растворителей ацетонитрил — раствор уксусной кислоты 2 г/л в соотношении 35: 65, в этих условиях на колонке Agilent Zorbax SB-C18 (4,6×250 мм, 5 мкм) анализировали традиционные китайские лекарства. Кроме того, метод ВЭЖХ применяется и для анализа а- и p-глицирретовых кислот, также содержащихся в данном растении [2]. В этом случае брали подвижную фазу состава: раствор ацетата аммония (10 мМ/л) — метанол -ацетонирил 40: 36: 24. Отечественные исследователи [3] для ВЭЖХ анализа кислоты использовали систему растворителей метанол — ледяная уксусная кислота — вода 60: 5: 35.
Экспериментальная часть
Исследования проводили на жидкостном хроматографе «Стайер» фирмы Аквилон (Россия-США-Чехия), снабженном колонкой Luna С-18 4,6*150 мм (Phenomenex, США), с содержанием углерода около 16%. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и раствора муравьиной кислоты (20 г/л) в соотношении 40: 60 при расходе элюента 1 мл/мин. Детектирование осуществляли при 257 нм, объем вводимой пробы составлял 20 мкл. Условия анализа были подобраны с учетом результатов исследований, представленных в [1, 2]. На первом этапе изучали хроматографическое поведение стандартного образца моноаммо-нийной соли кислоты глицирризиновой (Sigma), а затем анализировали различные образцы сырья, собран-
* Автор, с которым следует вести переписку.
ные в районе Кавказских Минеральных Вод (КМВ). Хроматографирование каждой пробы проводили трижды и затем усредняли полученные результаты.
Для анализа точную навеску сырья (2008 год сбора, район КМВ), около 1,0 г, измельченную до частиц размером не более 1 мм, помещали в колбу со шлифом, заливали 30 мл этилового спирта 70%, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 ч, затем эту операцию повторяли, используя 20 мл экстрагента. Полученные извлечения фильтровали в горячем виде в мерную колбу вместимостью 50 мл, а после охлаждения до комнатной температуры доводили до метки тем же растворителем и перемешивали. Полученный раствор перед анализом центрифугировали 5 мин при 7000 мин1.
В указанных условиях пик кислоты глицирризиновой фиксируется на хроматограмме на 8−9-й минутах при эффективности 6500±350 т.т. и коэффициенте асимметрии 0,85−1,0. Хроматографирование занимает 15 мин. Установлено, что максимальной степени извлечения можно достичь при однократной экстракции в течение 60 мин, добавляя к экстрагенту 5% раствор аммиака концентрированного.
Градуировочная зависимость площади пика кислоты глицирризиновой от концентрации наблюдается в широком диапазоне концентраций (0,05−1,0 мг/мл) и выражается уравнением у = 8162х + 29, коэффициент корреляции (г) равен 0,988. При построении градуировочного графика проводили пересчет концентрации моноаммонийной соли КГ на основание КГ. Далее устанавливали нижний предел количественного определения, используя метод «десяти сигма», проводя расчет по формуле
О =
10 х Ж& gt- ?
где 8Б — стандартное отклонение сигнала фоновых колебаний- 8 — коэффициент чувствительности.
Значения 8Б устанавливали на 5 параллельных определениях, а значение 8 (значение первой производной градуировочной функции при данных концентрациях) — по градуировочному графику, который строят при установлении линейности, используя формулу
? =
Уп+1 — Уп
Обсуждение результатов
В ходе исследований установлено, что стандартное отклонение величины фонового сигнала составляет
0,58, а коэффициент чувствительности — 8001, это позволяет считать величиной нижнего предела количественного определения концентрацию кислоты глицирризиновой в анализируемой пробе 0,73 мг/мл. Типичная хроматограмма извлечения из сырья представлена на рисунке 1.
Как следует из полученных методом ВЭЖХ данных (табл. 1), по содержанию КГ исследуемое сырье не соответствует фармакопейным требованиям.
Для подтверждения полученных результатов сырье подвергалось анализу методом спектрофотометрии по методике ГФ Х. При этом установлено, что полученное извлечение имеет красноватую окраску (халко-ны), а анализируемый раствор представляет собой слегка опалесцирующую жидкость, что требует дальнейших разведений, но это не гарантирует получения истинного раствора. Спектрофотометрически установлено, что содержание КГ в сырье составляет 6,93±0,45 (п=5), что соответствует требованиям ГФ Х, однако существенно превышает результаты, полученные методом ВЭЖХ.
тУ 700 600
500
400
300
200


глиг и ірриіі ірпп яі п та я книш і а
3 6
1 1
2, І 11
1
1 1 I V 1 & lt-1 йо 5 161 / 00 9,20 и 1 222 324| 25, 26
сМ
10 11 12 13 мин
Рис. 1. Хроматограмма извлечения из корня солодки

п
Таблица 1. Результаты определения кислоты глицирризиновой в корнях солодки
Метод Образец Спектрофотометрия ВЭЖХ Капиллярный электрофорез
Корень солодки 6,93±0,45 3,72±0,13 3,64±0,25
Следует отметить, что схема выделения моноаммонийной соли КГ, изложенная в ГФ Х, не совсем совершенна, существует целый ряд исследований по ее модификации [3]. Однако, на наш взгляд, для аналитических целей все эти схемы выделения КГ не совсем пригодны. Для установления истинного содержания КГ в сырье было принято использовать другой современный сепарационный метод.
В настоящее время для анализа слабых кислот может быть с успехом применен метод капиллярного электрофореза с использованием щелочных буферных растворов. В данной работе взят вариант капиллярного зонного электрофореза на немодифицированном кварцевом капилляре.
Работу проводили с использованием системы капиллярного электрофореза Капель 103 Р (НПФ Люмэкс, Санкт-Петербург) с кварцевым капилляром диаметром 50 мкм, общей длиной 75 см и эффективной длиной 65 см. Для подготовки капилляра и восстановления его поверхности проводили его последовательную промывку водой, 1 М раствором натрия гидроксида, водой, 1 М раствором кислоты хлороводородной, водой и затем ведущим электролитом. Детектирование осуществляли спектрофотометрически при 254 нм в катодной области капилляра. Работу проводили при комнатной температуре. В качестве ведущего электролита использовали раствор натрия тетрабората десятиводного, применение которого для анализа слабых кислот можно считать оптимальным. В [4] описано использование капиллярного электрофореза в боратном электролите с добавлением натрия додецилсульфата и тетрабутиламмоний бромида. В настоящем исследовании первоначально анализировался раствор моноаммонийной соли КГ (глицирам) фармакопейной чистоты. В условиях капиллярного зонного электрофореза в боратном электролите (10 мг/мл) данное вещество фиксируется в виде одиночного неоднородного пика. Добавление натрия додецилсульфата характера пика не изменяет. Модификация ведущего электролита р-циклодекстрином в количестве 1 мМ существенно изменила профиль электро-фореграммы, и кроме основного наблюдались еще два достаточно заметных пика (рис. 2, 3).
Это свидетельствует о том, что модификация электролита позволила отделить очень близкие по структуре вещества. Полученная в этих условиях электрофореграмма извлечения из сырья представлена на рисунке 4.
Рис. 2. Электрофореграмма глицирама без добавления Рис. 3. Электрофореграмма глицирама
Р-циклодекстрина с добавлением р-циклодекстрина
Рис. 4 Электрофореграмма извлечения из корня солодки
Для вычисления содержания КГ в сырье также был использован градуировочный график. Полученные результаты представлены в таблице 1. Сравнение данных показывает, что методами ВЭЖХ и КЭ удается получить результаты с удовлетворительной сходимостью, но они существенно отличаются от результатов, полученных методом спектрофотомерии.
Следующим этапом исследований стало использование КЭ и ВЭЖХ для анализа сиропа корня солодки. Данный препарат достаточно широко распространен на отечественном лекарственном рынке. Для его получения берут 4 части густого экстракта корня солодки с содержанием КГ не менее 14% и 96 частей сахарного сиропа. Минимальное содержание КГ в сиропе (по данным различных НД) — 0,4%. Методика выделения КГ из сиропа основана на обработке образца ацетоновым раствором трихлоруксусной кислоты, что позволяет осадить сахарозу. После фильтрования из ацетоновой фракции при помощи раствора аммиака осаждают КГ, отфильтровывают, затем осадок растворяют в воде и подвергают спектрофотометрическому анализу. Апробация данной методики показывает, что осаждение раствором аммиака КГ занимает много времени и требует охлаждения раствора для формирования осадка, что не отражено в НД. Поэтому при аккуратном выполнении всех аналитических процедур в различных образцах сиропа корня солодки определяется содержание КГ менее нормативного или на нижнем пределе при существенной величине относительного стандартного отклонения. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2. Результаты определения кислоты глицирризиновой в сиропе корня солодки
Образец Метод Спектрофотометрия ВЭЖХ Капиллярный электрофорез
Пятигорская фармфабрика- серия 17 082 006 0, З9±0,05 0, З11±0,006 0, З06±0,01З
Флора Кавказа- серия 40 808 0,58±0,09 0, З58±0,009 0, З50±0,014
Самарамедпром- серия 220 408 0, З7±0,08 0,254±0,011 0,250±0,012
Как следует из представленных результатов, методами КЭ и ВЭЖХ удается получить сопоставимые результаты по установлению содержания КГ как в корнях солодки, так и в сиропе из корней, а методику, основанную на предварительном выделении КГ из сырья, следует считать недостаточно объективной, о чем также сообщается в [3].
Для оценки качества сиропа корня солодки необходимы как разработка новой методики анализа, так и утверждение новых нормативов содержания КГ.
Список литературы
1. Hennell J.R., Lee S., Khoo C.S. The determination of glycyrrhizic acid in Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. (Zhi Gan Cao) root and the dried aqueous extract by LC-DAD // J. Pharm. Biomed. Anal. 2008. V. 47. P. 494−500.
2. Wang P., Li S.F.Y., Lee H.K. Simultaneous analysis of glycyrrhizin, paeoniflorin, quercetin, ferulic acid, liquiritin, formononetin, benzoic acid and isoliquiritigenin in the Chinese proprietary medicine Xiao Yao Wan by HPLC // J. Chromatograph. A. 1998. V. 811. № 1−2. P. 219−224.
3. Столярова О. В., Балтина Л. А., Михайлова Л. Р. и др. Оптимизация метода получения моноаммонийной соли глицирризиновой кислоты из корней солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis Fisch.) сибирских популяций // Химия в интересах устойчивого развития. 2008. Т. 16. № 5. С. 571−576.
4. Kvasnicka F., Voldrich M., Vyhnalek J. Determination of glycyrrhizin in liqueurs by on-line coupled capillary isota-chophoresis with capillary zone electrophoresis // J. Chromatogr. A. 2007. V. 1169. P. 239−242.
Поступило вредацию 27марта 2009 г.

Показать Свернуть
Заполнить форму текущей работой